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介紹PCR儀的兩種定量方法
來源₪╃:技術文章    釋出時間₪╃:2022-11-11    瀏覽₪╃:200次
   將熒光基團加入到PCR反應體系中··,透過不斷累積熒光訊號從而使對PCR全程的實時監測實現··,再根據標準曲線定量分析未知模板的方法··,即是熒光定量PCR技術╃✘✘↟。在實時熒光定量PCR中··,實時檢測全程PCR擴增過程··,按照反應時間和熒光訊號的變化能夠將一條曲線繪製成╃✘✘↟。
  定量方法
  在實時熒光PCR中··,模板的定量包括相對定量和定量2種方法╃✘✘↟。相對定量是指在一定樣品中靶序列相對於另一參照序列的量的變化╃✘✘↟。定量通常根據已知的標準曲線來使我們所感興趣基因的複製數確定╃✘✘↟。
  1.相對定量法
  相對定量法又分為比較Ct值的相對定量法和比較標準曲線的相對定量法兩種方法╃✘✘↟。
  (1)比較Ct值的相對定量法
  該方法是同時擴增待測靶基因片段和內參照基因片段··,擴增反應既能夠在兩個反應管中也能夠在一個反應管中進行··,並且透過兩者的ct值的差來測量╃✘✘↟。在採用此方法過程中··,相對量的計算需要用到數學公式╃✘✘↟。靶基因和內源控制物的擴增效率大體上相同是該方法的前提╃✘✘↟。因此應用過程中效率的偏移會或多或少影響實際複製數的估計╃✘✘↟。所以··,反應體系的最佳化的加強是目的基因和內參基因的擴增效率相等的保障╃✘✘↟。
  (2)比較標準曲線的相對定量法
  相對定量法指的是在一定樣本中··,靶序列相對於另一參照樣本量變化情況進行分析的方法··,在使用該方法過程中··,參照物必須準備··,因此定量標準曲線的繪製比較容易··,只要確定了標準品稀釋度就能夠進行對比分析╃✘✘↟。
  2.定量
  定量是透過已知的標準曲線推算出未知樣本的量的方法╃✘✘↟。該方法··,需要對標準樣品的濃度情況進行明確··,再將標準樣品稀釋╃✘✘↟。分為幾個不同梯度濃度然後進行反應測試╃✘✘↟。縱座標為測得的Ct值··,橫座標為標準品複製數的對數值··,從而將標準曲線繪製出來··,基於標準曲線··,在對未知樣品定量分析的過程中樣起始複製數能夠透過ct值被推算出來╃✘✘↟。
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